La hidroxicloroquina, un derivado menos tóxico de la cloroquina, es eficaz para inhibir la infección por SARS-CoV-2 in vitro
Recientemente hemos informado que dos fármacos, remdesivir (GS-5734) y fosfato de cloroquina (CQ), inhibieron eficazmente la infección por SARS-CoV-2 in vitro 1 . Remdesivir es un profármaco análogo de nucleósidos desarrollado por Gilead Sciences (EE. UU.). Un informe de caso reciente mostró que el tratamiento con remdesivir mejoró la condición clínica del primer paciente infectado por SARS-CoV-2 en los Estados Unidos 2, y un ensayo clínico de fase III de remdesivir contra el SARS-CoV-2 se lanzó en Wuhan el 4 de febrero de 2020. Sin embargo, como fármaco experimental, no se espera que remdesivir esté ampliamente disponible para tratar a un gran número de pacientes en un de manera oportuna. Por lo tanto, de los dos medicamentos potenciales, CQ parece ser el medicamento de elección para uso a gran escala debido a su disponibilidad, registro de seguridad comprobado y un costo relativamente bajo. A la luz de los datos clínicos preliminares, CQ se ha agregado a la lista de medicamentos de prueba en las Pautas para el diagnóstico y el tratamiento de COVID-19 (sexta edición) publicada por la Comisión Nacional de Salud de la República Popular de China.
La CQ (N4- (7-cloro-4-quinolinil) -N1, N1-dietil-1,4-pentanodiamina) se ha utilizado durante mucho tiempo para tratar la malaria y la amebiasis. Sin embargo, Plasmodium falciparum desarrolló una resistencia generalizada, y con el desarrollo de nuevos antipalúdicos, se ha convertido en una opción para la profilaxis de la malaria. Además, una sobredosis de CQ puede causar intoxicación aguda y muerte 3 . En los últimos años, debido a la utilización poco frecuente de CQ en la práctica clínica, su producción y oferta en el mercado se redujo considerablemente, al menos en China. El sulfato de hidroxicloroquina (HCQ), un derivado de CQ, se sintetizó por primera vez en 1946 al introducir un grupo hidroxilo en CQ y se demostró que es mucho menos tóxico (~ 40%) que CQ en animales 4. Más importante aún, HCQ todavía está ampliamente disponible para tratar enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide. Dado que CQ y HCQ comparten estructuras químicas y mecanismos similares de actuar como una base débil e inmunomodulador, es fácil conjurar la idea de que HCQ puede ser un candidato potente para tratar la infección por SARS-CoV-2. En realidad, a partir del 23 de febrero de 2020, se encontraron siete registros de ensayos clínicos en el Registro de ensayos clínicos chinos ( http://www.chictr.org.cn ) por usar HCQ para tratar COVID-19. Si HCQ es tan eficaz como CQ en el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2 aún carece de evidencia experimental.
Con este fin, evaluamos el efecto antiviral de HCQ contra la infección por SARS-CoV-2 en comparación con CQ in vitro. Primero, la citotoxicidad de HCQ y CQ en células VeroE6 de riñón de mono verde africano (ATCC-1586) se midió mediante el ensayo CCK8 estándar, y el resultado mostró que los valores de concentración citotóxica al 50% (CC 50 ) de CQ y HCQ fueron 273.20 y 249.50 μM, respectivamente, que no son significativamente diferentes entre sí (Fig. 1a ). Para comparar mejor la actividad antiviral de CQ versus HCQ, las curvas de dosis-respuesta de los dos compuestos contra el SARS-CoV-2 se determinaron en cuatro multiplicidades diferentes de infección (MOI) mediante la cuantificación de los números de copias de ARN viral en el sobrenadante celular a 48 h después de la infección (pi). Los datos resumidos en la figura 1ay la Tabla complementaria S1 muestran que, en todas las MOI (0.01, 0.02, 0.2 y 0.8), la concentración efectiva máxima del 50% (EC 50 ) para CQ (2.71, 3.81, 7.14 y 7.36 μM) fue menor que la de HCQ (4.51, 4.06, 17.31 y 12.96 μM). Las diferencias en los valores de CE 50 fueron estadísticamente significativas con un MOI de 0.01 ( P <0.05) y un MOI de 0.2 ( P <0.001) (Tabla complementaria S1 ). Vale la pena señalar que los valores de CE 50 de CQ parecían ser un poco más altos que los de nuestro informe anterior (1.13 μM con un MOI de 0.05) 1, lo que probablemente se deba a la adaptación del virus en el cultivo celular que aumentó significativamente la infectividad viral al pasar continuamente. En consecuencia, el índice de selectividad (SI = CC 50 / EC 50 ) de CQ (100.81, 71.71, 38.26 y 37.12) fue mayor que el de HCQ (55.32, 61.45, 14.41, 19.25) con MOI de 0.01, 0.02, 0.2, y 0.8, respectivamente. Estos resultados fueron corroborados por microscopía de inmunofluorescencia como lo demuestran los diferentes niveles de expresión de la nucleoproteína del virus (NP) a las concentraciones de fármaco indicadas a las 48 h pi (Figura complementaria S1 ). Tomados en conjunto, los datos sugieren que la actividad anti-SARS-CoV-2 de HCQ parece ser menos potente en comparación con CQ, al menos en ciertas MOI.
Una citotoxicidad y las actividades antivirales de CQ y HCQ. La citotoxicidad de los dos fármacos en las células Vero E6 se determinó mediante ensayos CCK-8. Las células Vero E6 se trataron con diferentes dosis de cualquiera de los compuestos o con PBS en los controles durante 1 hora y luego se infectaron con SARS-CoV-2 a MOI de 0.01, 0.02, 0.2 y 0.8. El rendimiento del virus en el sobrenadante celular se cuantificó mediante qRT-PCR a las 48 h pi. El eje Y representa la media del porcentaje de inhibición normalizada para el grupo PBS. Los experimentos se repitieron dos veces. b , cMecanismo de CQ y HCQ en la inhibición de la entrada de virus. Las células Vero E6 se trataron con CQ o HCQ (50 μM) durante 1 h, seguido de la unión del virus (MOI = 10) a 4 ° C durante 1 h. Luego, se eliminaron los viriones no unidos, y las células se suplementaron adicionalmente con medio fresco que contenía fármaco a 37 ° C durante 90 minutos antes de ser fijadas y teñidas con IFA usando anticuerpo anti-NP para viriones (rojo) y anticuerpos contra EEA1 para EEs ( verde) o LAMP1 para ELs (verde). Los núcleos (azul) se tiñeron con colorante Hoechst. La porción de viriones que se ubicaron conjuntamente con EE o EL en cada grupo ( n > 30 células) se cuantificó y se muestra en b . Imágenes microscópicas confocales representativas de partículas virales (rojo), EEA1 + EEs (verde) o LAMP1 +Los EL (verdes) en cada grupo se muestran en c . Las imágenes ampliadas en los cuadros indican un solo virión que contiene vesículas. Las flechas indicaban las vesículas anormalmente agrandadas. Barras, 5 μm. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con GraphPad Prism ( F = 102.8, df = 5,182, *** P <0.001).
Tanto CQ como HCQ son bases débiles que se sabe que elevan el pH de los orgánulos intracelulares ácidos, como los endosomas / lisosomas, esenciales para la fusión de membranas 5 . Además, CQ podría inhibir la entrada de SARS-CoV al cambiar la glucosilación del receptor ACE2 y la proteína 6 de pico . El experimento del momento de la adición confirmó que HCQ inhibió efectivamente el paso de entrada, así como las etapas posteriores al ingreso de SARS-CoV-2, que también se encontraron después del tratamiento con CQ (Figura complementaria S2) Para explorar más a fondo el mecanismo de acción detallado de CQ y HCQ en la inhibición de la entrada de virus, se analizó la localización conjunta de viriones con endosomas tempranos (EE) o endolisosomas (EL) mediante análisis de inmunofluorescencia (IFA) y microscopía confocal. El análisis de cuantificación mostró que, a los 90 minutos pi en las células no tratadas, se observó el 16,2% de los viriones internalizados (anti-NP, rojo) en EEs positivos del antígeno endosómico 1 (EEA1) temprano (verde), mientras que se observaron más viriones (34,3%) transportado a la proteína endosomal-lisosomal tardía LAMP1 + ELs (verde) ( n > 30 células para cada grupo). Por el contrario, en presencia de CQ o HCQ, significativamente más viriones (35.3% para CQ y 29.2% para HCQ; P <0.001) se detectaron en los EE, mientras que se encontró que muy pocos viriones (2.4% para CQ y 0.03% para HCQ; P <0.001) se ubicaron junto con LAMP1 + EL ( n > 30 células) (Fig. 1b c ). Esto sugirió que tanto CQ como HCQ bloquearon el transporte de SARS-CoV-2 de EE a EL, lo que parece ser un requisito para liberar el genoma viral como en el caso de SARS-CoV 7 .
Curiosamente, encontramos que el tratamiento con CQ y HCQ causó cambios notables en el número y tamaño / morfología de EE y EL (Fig. 1c ). En las células no tratadas, la mayoría de los EE eran mucho más pequeños que los EL (Fig. 1c ). En las células tratadas con CQ y HCQ, se observaron vesículas EE anormalmente agrandadas (Fig. 1c , flechas en los paneles superiores), muchas de las cuales son incluso más grandes que los EL en las células no tratadas. Esto está de acuerdo con el informe anterior de que el tratamiento con CQ indujo la formación de vesículas citoplasmáticas expandidas 8. Dentro de las vesículas EE, los viriones (rojo) se localizaron alrededor de la membrana (verde) de la vesícula. El tratamiento CQ no causó cambios obvios en el número y el tamaño de los EL; sin embargo, la estructura vesicular regular parecía estar alterada, al menos parcialmente. Por el contrario, en las células tratadas con HCQ, el tamaño y el número de EL aumentaron significativamente (Fig. 1c , flechas en los paneles inferiores).
Dado que la acidificación es crucial para la maduración y función del endosoma, suponemos que la maduración del endosoma podría estar bloqueada en las etapas intermedias de la endocitosis, lo que da como resultado el fracaso del transporte adicional de viriones al sitio de liberación final. Se informó que CQ eleva el pH del lisosoma de aproximadamente 4.5 a 6.5 a 100 μM 9 . Hasta donde sabemos, faltan estudios sobre el impacto de HCQ en la morfología y los valores de pH de los endosomas / lisosomas. Nuestras observaciones sugirieron que el modo de acción de CQ y HCQ parece ser distinto en ciertos aspectos.
Se ha informado que la absorción oral de CQ y HCQ en humanos es muy eficiente. En los animales, ambos fármacos comparten patrones de distribución de tejidos similares, con altas concentraciones en el hígado, bazo, riñón y pulmón alcanzando niveles de 200 a 700 veces más altos que los del plasma 10 . Se informó que una dosis segura (6–6.5 mg / kg por día) de sulfato de HCQ podría generar niveles séricos de 1.4–1.5 μM en humanos 11 . Por lo tanto, con una dosis segura, es probable que se logre la concentración de HCQ en los tejidos anteriores para inhibir la infección por SARS-CoV-2.
La investigación clínica encontró que se detectó una alta concentración de citoquinas en el plasma de pacientes críticos infectados con SARS-CoV-2, lo que sugiere que la tormenta de citocinas se asoció con la gravedad de la enfermedad 12. Además de su actividad antiviral directa, HCQ es un agente antiinflamatorio seguro y exitoso que se ha utilizado ampliamente en enfermedades autoinmunes y puede disminuir significativamente la producción de citocinas y, en particular, factores proinflamatorios. Por lo tanto, en pacientes con COVID-19, el HCQ también puede contribuir a atenuar la respuesta inflamatoria. En conclusión, nuestros resultados muestran que HCQ puede inhibir eficazmente la infección por SARS-CoV-2 in vitro. En combinación con su función antiinflamatoria, predecimos que el medicamento tiene un buen potencial para combatir la enfermedad. Esta posibilidad aguarda confirmación por ensayos clínicos. Tenemos que señalar que, aunque el HCQ es menos tóxico que el CQ, el uso prolongado y la sobredosis aún pueden causar envenenamiento.
Referencias
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Agradecimientos
Agradecemos al profesor Zhengli Shi y al Dr. Xinglou Yang del Instituto de Virología de Wuhan y al profesor Fei Deng del Centro Nacional de Recursos de Virus por proporcionar la cepa SARS-CoV-2 (nCoV-2019BetaCoV / Wuhan / WIV04 / 2019); Profesor Xiulian Sun por su amable ayuda en el análisis estadístico; Profesor Zhenhua Zheng por proporcionar amablemente el anticuerpo policlonal de conejo anti-LAMP1; Prof. Zhengli Shi por proporcionar amablemente el anticuerpo policlonal anti-NP; Beijing Savant Biotechnology Co., Ltd por proporcionar amablemente el anticuerpo monoclonal anti-NP; Min Zhou y Xijia Liu por su ayuda con este estudio; Jia Wu, Jun Liu, Hao Tang y Tao Du del Laboratorio BSL-3 y el Dr. Ding Gao de la facultad central del Instituto de Virología Wuhan por su apoyo crítico; Profesor Gengfu Xiao, El profesor Yanyi Wang y otros colegas del Instituto de Virología de Wuhan y el Laboratorio Nacional de Bioseguridad de Wuhan por su excelente coordinación; y el Dr. Basil Arif por la edición científica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los principales proyectos nacionales de ciencia y tecnología para "Innovación y desarrollo de nuevas drogas importantes" (2018ZX09711003 a WZ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31621061 a ZH) y la Ciencia y Tecnología de Hubei Proyecto (2020FCA003 a ZH).
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Contribuciones
ZH, MW y WZ concibieron y diseñaron los experimentos y proporcionaron la aprobación final del manuscrito. JL, RC, MX, XW, HZ, HH e YL participaron en múltiples experimentos; Todos los autores analizaron los datos. MW, RC, JL y ZH escribieron el manuscrito.
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Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
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